国家卫生和计划生育委员会办公厅


关于印发《医院人感染H7N9禽流感病毒核酸检测标准操作程序》等技术规范的通知

　　
卫办医政函〔2013〕402号



各省、自治区、直辖市卫生厅局（卫生计生委），新疆生产建设兵团卫生局：

　　根据人感染H7N9禽流感疫情联防联控工作机制会议议定事项及《关于医院开展人感染H7N9禽流感病毒核酸检测有关工作的通知》（卫办医政函〔2013〕383号，以下简称《通知》）精神，为指导医院做好人感染H7N9禽流感病毒核酸检测工作，我委组织制定了《医院人感染H7N9禽流感病毒核酸检测标准操作程序》（附件1），并委托中国疾控中心制定了《人感染H7N9禽流感病毒核酸检测实验室生物安全保障基本要求》（附件2）等技术规范。现转发给你们（可从国家卫生和计划生育委员会网站医政管理栏目中下载），供医院在开展人感染H7N9禽流感病毒核酸检测时参考使用。

　　各省级卫生（卫生计生）行政部门要按照《通知》有关要求，组建省级疾控机构实验室和省级临床检验专家共同组成的专家组，对医院开展人感染H7N9禽流感病毒核酸检测工作提供技术指导和支持，负责医院实验室核酸检测质量控制工作。要组织本辖区人感染H7N9禽流感病毒核酸检测定点医院检验人员进行培训，认真学习掌握相关要求，提高检验人员技术能力和水平。医院开展病毒核酸检测时，应当按照技术规范有关要求，规范开展检测工作，重视实验室质量控制，保障实验室生物安全，做好检验人员职业防护，保证检测结果科学、可靠。



附件：1.医院人感染H7N9禽流感病毒核酸检测标准操作程序.docx

2.H7N9禽流感病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）说明书.docx



国家卫生和计划生育委员会办公厅

2013年5月16日





医院人感染H7N9禽流感病毒核酸检测标准操作程序


　　　　 
　　　　一、目的
　　　　确保人感染H7N9禽流感病毒核酸检测过程标准化、规范化，降低人为不规范操作对检测结果造成的影响，保证结果的准确性和可重复性。
　　　　二、适用范围
　　　　医疗机构临床基因扩增检验实验室按照《关于医院开展人感染H7N9禽流感病毒核酸检测有关工作的通知》（卫办医政函〔2013〕383号）和《关于做好医疗机构人感染H7N9禽流感检测试剂供给保障工作的通知》（卫发明电〔2013〕29号）有关要求，使用国家疾病预防控制中心制备或商品化试剂盒开展人感染H7N9禽流感病毒核酸检测工作。
　　　　三、样本采集、运送和保存
　　　　尽量采集病例发病早期的呼吸道样本(上呼吸道样本包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液和鼻洗液, 下呼吸道样本包括痰液、气管吸取物、肺洗液、肺组织等)。可将鼻、咽拭子收集于同一采样管中，以便提高检出率。患者有下呼吸道样本时，应优先采集。
　　　　根据试剂说明书对样本采集方法有关要求，制订样本采集标准操作程序（SOP），并组织样本采集人员进行培训及考核。样本的采集应当严格按照SOP进行。
　　　　样本采集后，按照《人间传染病的病原微生物名录》中高致病性禽流感病毒的相关规定进行包装，用密封容器立即送往实验室。若气温高时，需放入冰块降温。样本抵达实验室后，应尽快进行检测，24小时内能检测的样本可置于2～8℃暂时保存，24小时内无法检测的样本则应置于≤-70℃状态保存。如无-70℃保存条件时，可于-20℃冰箱暂存。样本避免反复冻融。
　　　　样本采集、处理、运输及保存不当时，可因病毒RNA降解出现假阴性结果，也可因为样本“污染”出现假阳性结果。
　　　　四、PCR检测
　　　　（一）样本处理
　　　　样本的核酸提取应当在样本处理区进行。按所采用的商品化试剂盒说明书要求，取适量待检样本、阳性及阴性对照进行核酸提取。样本应尽可能新鲜，提取过程应严防RNA酶污染及操作不当导致的RNA降解。提取过程如涉及离心步骤，应采用低温冷冻离心机；在生物安全柜内进行加样、提取过程中，为防止RNA降解，可将试管架置于托盘内平铺的碎冰上。提取好的RNA应及时用于检测，否则应当-70℃保存。如无-70℃保存条件，可于-20℃冰箱暂存。
　　　　（二）试剂准备
　　　　试剂准备应当在试剂准备区进行。根据所用的试剂盒，样本可进行甲型流感病毒核酸、禽流感H7亚型或H7N9病毒核酸的检测。试剂的配制按所用商品化试剂盒说明书进行。除酶混合物外，其它试剂在使用前应当在室温充分复融，混匀并瞬时低速离心。反应液分装时尽量避免产生气泡，上机前注意检查各反应管是否盖紧，以免管内溶液泄露污染仪器。分装有扩增反应液的反应管应当扣盖或装入密实袋内再转移至样本处理区。
　　　　（三）加样
　　　　加样应当在样本处理区进行。加样时应当使样品完全落入反应液中，不应有样品粘附于管壁上，加样后应尽快盖紧管盖。
　　　　按试剂、仪器说明书完成加样和PCR反应管准备。
　　　　（四）PCR扩增检测
　　　　PCR扩增检测在扩增区进行。待检PCR管转移至扩增区，按顺序置于PCR仪上，编辑样本信息，按试剂和仪器说明书设定循环参数。
　　　　（五）结果分析
　　　　根据所用试剂盒说明书设置基线值（baseline）。荧光阈值（threshold）设定以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点为原则，且Ct值应大于所设置的扩增循环数（或显示为undet）。使用仪器配套软件自动分析结果。
　　　　（六）质量控制
　　　　检测过程对可能出现的假阳性和假阴性进行质量控制，除了检测商品试剂盒所提供阳性和阴性对照外，每次临床样本检测时，至少应当有1份弱阳性和3份阴性质控样本（多份阴性质控样本设置对实验室“污染”所致假阳性的监控更为有效），随机放在所检测标本的中间。弱阳性质控样本可为检测阳性的灭活稀释后保存的临床样本、灭活病毒或假病毒颗粒等，如所采用的商品化试剂盒有“内标”控制假阴性，或弱阳性质控样本来源困难，可暂不设弱阳性质控。阴性质控样本采用标本采集管内溶液即可。质控样本应与临床标本同等对待，参与样本核酸提取和扩增检测全过程。
　　　　试剂盒中的阳性和阴性对照用于判断实验室的有效性，按试剂盒说明书进行。
　　　　（七）实验结果的判定与解释。
　　　　按照试剂盒说明书进行。对于出现弱阳性结果的样本应进行重复检测，并注意与可能的实验室轻度或样本交叉“污染”所致假阳性结果区别。
　　　　五、检测结果报告
　　　　按照试剂盒说明书进行。
　　　　六、其它注意事项
　　　　（一）人感染H7N9禽流感病毒实验室活动、样本采集和运输按照《人间传染的病原微生物名录》中高致病性禽流感病毒进行管理。从事人感染禽流感检测的技术人员必须经过生物安全培训并具备相应的实验技能，在检测过程中必须采取生物安全防护措施（使用眼罩、N95型口罩等）。样本核酸提取必须在Ⅱ级生物安全实验室，经过年检合格的二级生物安全柜内进行。实验室应具有良好的通风。
　　　　（二）注意仪器设备的日常和定期维护，加样器、扩增仪和温育设备应进行定期校准。试剂盒及一次性使用的无DNA酶和RNA酶PCR反应管、离心管、带滤芯吸头等应进行每批质检。
　　　　（三）实验应严格分区操作；各区物品、工作服等均应当专区专用，不得交叉使用。实验后应及时清洁工作台，以防污染。
　　　　（四）每批实验室后，可采取实验室通风、10%次氯酸钠溶液擦洗地台面、紫外照射等措施，消除可能存在的扩增产物气溶胶污染。
　　　　（五）使用中国疾控中心制备试剂开展检测工作时，可参考相应试剂盒说明书（见附件1、2）有关要求。
　　　　 
附件：1.H7N9亚型禽流感病毒RNA检测试剂盒（荧光PCR法）说明书
2.H7N9禽流感病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）说明书
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
H7N9亚型禽流感病毒RNA检测试剂盒（荧光PCR法）说明书
 
　　　　【产品名称】
　　　　通用名称：H7N9亚型禽流感病毒RNA检测试剂盒（荧光PCR法）
　　　　英文名称：Diagnostic Kit for H7N9 subtype avian flu virus RNA（Fluorescence PCR）
　　　　【包装规格】48人份/盒。
　　　　【预期用途】
　　　　本试剂用于对咽拭子样本中H7N9亚型禽流感病毒RNA进行定性检测，用于H7N9禽流感病毒感染的辅助诊断及流行病学监控。
　　　　【检验原理】根据荧光PCR技术原理，针对H7N9亚型禽流感病毒的HA基因和NA基因设计特异性引物和Taqman探针，通过荧光PCR检测仪进行检测，从而实现对H7N9亚型禽流感病毒RNA的定性检测。试剂盒以正常人上皮细胞中广泛存在的核糖核酸酶P（RNase P）的mRNA为正常人体细胞对照，对提取和检测过程进行监控。
　　　　【主要组成成分】
　　　　 
　　　 
名称 成分 　　规格 数量(管)
H7反应液 　　含内标RNP 、H7亚型特异基因的引物探针混合液 1.0ml/管 1
N9反应液 　　含内标RNP 、N9亚型特异基因的引物探针混合液 1.0ml/管 1
DNA聚合酶 　　DNA聚合酶，不可用其他同类DNA聚合酶替代 60μl /管 1
逆转录酶 　　逆转录酶，不可用其他同类逆转录酶替代 60μl /管 1
阳性对照 　　RNP、H7、N9 RNA假病毒混合物 1.0ml/管 1
阴性对照 　　DEPC水 1.0ml/管 1
　　本品各组成成分均不得与其他产品或不同批号产品中的相应组成成分进行互换。
　　 
　　　　本品不包含，但对试验必须的设备和试剂：
　　　　生物安全柜、台式离心机、旋涡震荡器、拭子、采样管、无菌病毒采样液、1.5 ml无核酸酶的离心管、全自动荧光PCR检测仪专用PCR扩增管和核酸分离试剂盒(硅胶膜吸附法，北京金豪制药股份有限公司，Cat：BJH101)。
　　　　【储存条件及有效期】-20℃冷冻保存，有效期2个月，阳性对照反复冻融次数不得超过5次。
　　　　【适用仪器】RG3000、LightCycler、ABI Prism 7500、ABI Prism 7000型全自动荧光PCR检测仪。
　　　　【样本要求】
　　　　1. 样本类型：咽拭子。推荐使用金豪公司生产的微生物采样及运送管（12人份/盒）。
　　　　2. 拭子、采样管和保存液：
　　　　2.1拭子选择：应使用头部为合成纤维（例如，聚酯纤维），杆部为铝或塑料的拭子。
　　　　2.2采样管：外螺旋口、耐-70℃冻存，可容纳3 ml病毒采样液。
　　　　2.3无菌病毒采样液：应含有蛋白质稳定剂，阻止细菌和真菌生产的抗生素，缓冲液，经无菌处理。
　　　　3.样本采集、运输和保存：
　　　　由于H7N9亚型禽流感病毒为呼吸道传播病毒，有关生物安全应按照“《人间传染的病原微生物名录》”中高致病性禽流感病毒进行管理。
　　　　3.1采集：采集病人发病3日内的咽拭子标本，用于病原检测。用微生物采样及运送管内的采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有3ml保存液的15ml外螺旋盖采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥，外表贴上带有唯一识别号码的标签。4℃暂存并在48小时内送达实验室。
　　　　3.2保存和运输：新鲜采集样本应在4℃条件下48小时运送到检测实验室。保存样本可在-20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于-70℃冰箱。冷冻样本应在冷冻条件下送至实验室。运输时在包装箱内填充吸水材料，运输过程中保持标本采集管直立状态，不能倾斜。
　　　　样本送至实验室后，立即进行处理和分装，避免反复冻融。临床样本保存在4℃不能超过4天。
　　　　4.咽拭子标本的处理
　　　　咽拭子要在标本保存液中充分搅动（至少 40 下），以洗脱拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等，用于病毒分离时，需要冻融一次（防止多次冻融），使细胞破裂，释放病毒颗粒。然后在4℃条件下，10000rpm离心20分钟，用上清接种细胞或直接提取RNA。如果发现有细菌污染，须用滤器过滤除菌。
　　　　【检验方法】
　　　　1. 核酸提取：
　　　　取200μl咽拭子样本进行核酸提取。采用北京金豪制药股份有限公司的核酸分离试剂盒 (硅胶膜吸附法)，该试剂盒可用于对呼吸道悬浮液样本中的病毒RNA提取，并按试剂盒说明书要求操作。
　　　　本品的阳性对照和阴性对照均参与核酸提取。
　　　　1.1. 准备及注意事项：
　　　　1.1.1 分别在洗液A瓶和洗液B瓶中加入16ml和60ml无水乙醇，颠倒充分混匀，并在瓶身上加以标识。
　　　　1.1.2  吸取所需的洗脱液，加至一无核酸酶的eppendorf管中，于70℃预热。
　　　　1.1.3  冷冻样本应室温融化，轻微震荡混匀后使用。
　　　　1.1.4  区分操作中的离心设置（rpm和g），本产品操作过程均为室温离心。
　　　　1.1.5  助沉剂在低温保存时可能呈胶状，吹打混匀即可使用。
　　　　1.2. 样本裂解及核酸吸附
　　　　1.2.1  在1.5ml无核酸酶的离心管中加入10μl助沉剂和400μl裂解液，加入200μl待处理样本，剧烈震荡2分钟，室温静置10分钟。
　　　　注：如样本体积小于或大于200μl，需按比例改变助沉剂、裂解液以及无水乙醇体积。体积大于400μl样本应分多次进行处理。
　　　　1.2.2  加入480μl无水乙醇，颠倒混匀，吸取600μl裂解混合物转移到核酸吸附柱中。
　　　　注：如样本体积小于或大于200μl，需按比例改变乙醇用量。
　　　　1.2.3  3500g离心2分钟，取下套管，倒掉套管中的液体。将剩余裂解混合物转移至核酸吸附柱，重新离心一次，弃套管中的液体。
　　　　1.2.4  将核酸吸附柱重新装入套管，6000g离心1分钟，倒掉套管中的液体。
　　　　1.3. 核酸纯化
　　　　1.3.1  将核酸吸附柱重新装入套管，在核酸吸附柱中加入500μl洗液A，6000g离心1分钟，将核酸吸附柱装入一个干净套管中。
　　　　1.3.2  在核酸吸附柱中加入500μl洗液B，静置1分钟，6000g离心1分钟。
　　　　1.3.3  倒掉套管中的液体，将核酸吸附柱重新装入套管。
　　　　1.3.4  重复一次1.3.2步骤(本步骤不用静置1分钟)。
　　　　1.3.5  将核酸吸附柱换一新套管，13000rpm离心3分钟。
　　　　1.4. 核酸洗脱
　　　　1.4.1  将核酸吸附柱装入一无核酸酶1.5ml离心管，小心在吸附膜中央加入50μl预热洗脱液，室温静置4分钟。
　　　　1.4.2  10000 rpm离心2分钟，离心管中液体即待测样本RNA。
　　　　2. PCR扩增：
　　　　2.1 实验设计：
　　　　2.1.1待检样本检测：每份样本分别使用2种反应液（H7和N9反应液）进行检测，综合2种反应液的检测结果对样本进行判定。
　　　　2.1.2对照品检测：每次试验都应设置阴性对照和阳性对照。
　　　　2.2反应体系的配制：
　　　　2.2.1准备工作：将2种反应液（H7和N9反应液）融化后振荡混匀，离心6000rpm 10秒。
　　　　2.2.2 2种反应体系（H7和N9）的配制：取2个1.5ml 无核酸酶离心管，计算待测样本数量(n)，分别取20μl×（n+2）反应液（H7和N9）、0.5μl×（n+2）DNA聚合酶和0.5μl×（n+2）逆转录酶充分混匀，离心6000rpm 10秒。
　　　　n + 2 = n份样本+1份阳性对照+1份阴性对照；
　　　　2.3反应体系分管：
　　　　每份待测样本设置2个PCR扩增管（H7和N9），分别将每种反应体系按20μl/管分装至对应的PCR扩增管中。
　　　　2.4加样：
　　　　每份待测样本RNA、阳性对照、阴性对照以5μl/管分别加入2个PCR扩增管中。
　　　　2.5扩增检测：
　　　　将加样后的PCR扩增管分别转移到全自动荧光定量PCR检测仪上进行扩增检测，不同仪器的设置如下：
　　　　2.5.1全自动荧光定量PCR检测仪（RG3000、ABI Prism 7500、ABI Prism 7000型）扩增程序：
　　　　对于ABI Prism 7500、ABI Prism 7000型全自动荧光定量PCR检测仪，荧光信号设置为：Reporter Dye1：FAM、JOE/VIC，Quencher Dye1：NONE，Passive Reference：NONE。其他型号仪器可设置为FAM和HEX通道。荧光PCR扩增程序的设置见表1。反应总体积为25μl。
表1.荧光PCR扩增程序
　　步骤 　反应温度 　　时间 是否采集光 循环数
　　逆转录及变性 　50℃ 　30分钟 　　否 　　1
　95℃ 　3分钟 　　否
　　预扩增 　95℃ 　15秒 　　否 　　5
　50℃ 　30秒 　　否
　72℃ 　1分钟 　　否
　扩增及荧光收集 　95℃ 　10秒 　　否 　　40
　55℃ 　40秒 　　是
　　　　2.5.2 全自动荧光定量PCR仪（Roche LightCycler系列）扩增程序：
　　　　选择FAM、HEX通道收集荧光。荧光PCR扩增程序见表2。
表2.荧光PCR扩增程序
　　步骤 反应温度 　　时间 是否采集荧光 循环数
逆转录及变性 50℃ 　　30分钟 　　否 　　1
93℃ 　　3分钟 　　否
　　预扩增 93℃ 　　15秒 　　否 　　5
50℃ 　　30秒 　　否
72℃ 　　1分钟 　　否
扩增及荧光收集 93℃ 　　10秒 　　否 　　40
55℃ 　　40秒 　　是
　　 
　　　　3. 结果分析：
　　　　3.1本品H7荧光探针的报告荧光为FAM，N9荧光探针的报告荧光为FAM，RNP荧光探针的报告荧光为HEX。所以应选择FAM通道和HEX通道分析试验结果。
　　　　3.2 基线（Baseline）范围根据仪器要求设定，目的为校正背景荧光干扰，终止循环（End）一般设置为最强样本出现扩增信号的前3-4个循环。
　　　　3.3 阈值线用于判断样本是否扩增，应调整使阈值线高于荧光背景和阴性对照的荧光信号，或点击分析（Analysis）自动获得。
　　　　4. 质量控制：
　　　　每次试验应设置阳性对照和阴性对照，且应符合以下要求，否则试验结果不成立。
　　　　4.1阴性对照无Ct值或Ct值为0。
　　　　4.2 阳性对照Ct值小于30.0。
　　　　【参考值（参考范围）】
　　　　Ct值≤37.0报告该反应阳性；
　　　　无Ct值或Ct值为0报告该反应阴性；
　　　　37.0＜Ct值＜40.0为灰区；
　　　　内标RNP有效的范围为：0＜Ct值＜33.0；
　　　　【检验结果的解释】
　　　　1. 在内标RNP结果成立的条件下各种判读模式如下：
反应液 模式1 模式2 模式3 模式4
H7 - - + +
N9 - + - +
RNP + + + +
结果判断 H7N9亚型禽流感病毒RNA阴性 H7N9亚型禽流感病毒RNA阴性 H7N9亚型禽流感病毒RNA阴性 H7N9亚型禽流感病毒RNA阳性
　　注：在内标RNP结果不成立的条件下视为检测异常，应重新采样检测。
　　　　2. 结果在灰区的样本需重复试验：取200μl样本重新提取RNA（核酸分离试剂盒中裂解液、无水乙醇的用量加倍，其他组分的用量不变）并检测。复检结果Ct＜40.0的样本为阳性，否则为阴性。
　　　　3. 内标RNP检测靶物质为正常人上皮细胞中广泛存在的核糖核酸酶P（RNase P）的mRNA，用于对样本中RNA的提取和扩增检测过程进行有效监控。
　　　　如果该份样本的RNP检测 Ct值≥33.0，可能为以下原因：
　　　　3.1 未采集到足够的正常人上皮细胞，应重新采样。
　　　　3.2核酸提取过程异常，导致RNA损失，应重新提取。
　　　　3.3样本中存在RT-PCR抑制物质，可稀释后检测；
　　　　【检验方法的局限性】
　　　　1.样本中RNA浓度低于本产品的最低检出值（100copies/ml）时可能出现假阴性。
　　　　2.目前研究显示，发病后两日内取样检测，病毒RNA检出率最高，随发病时间的延长，病毒被清除，病毒核酸的检出水平迅速下降。因此应在发病后尽早采样，必要时可采用多部位取样检测。临床评价应结合其他临床症状和实验室检测指标进行判断。
　　　　【产品性能指标】
　　　　1.本品可最低检出100copies/ml稀释物。
　　　　2.本品对季节性流感（H1N1以及H3N2）灭活病毒、B型流感灭活病毒、高致病性禽流感灭活病毒（H5N1）RNA进行检测，结果为阴性。
　　　　【注意事项】
　　　　1.开始检测前请仔细阅读本说明书全文，并严格按照要求进行操作。
　　　　2.实验室配置和试验操作请按照《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》和《临床基因扩增检验实验室工作规范》进行；整个检测过程应严格分区进行：PCR反应体系的配置区；标本处理、加样区；各区使用的仪器、设备、耗材和工作服应独立专用。
　　　　3.H7N9亚型禽流感为经呼吸道传播疾病，应按照相关要求进行。样本的采集、处理、运输和保存均存在一定生物危害。样本的采集、运输和保存应按照乙类传染病进行管理；标本的提取必须在生物安全二级实验室的负压生物安全柜中完成；试验中接触过标准品和对照品的废弃物品（如吸头）、扩增完毕的离心管、标本等应进行无害化处理后方可丢弃。
　　　　4.不同批号的试剂请勿混用，请在有效期内使用试剂盒。
　　　　5. 本产品仅用于体外诊断检测。
　　　　【参考文献】
　　　　1. 微生物和生物医学实验室生物安全通用准则（WS 233-2002）
　　　　2.《人感染H7N9禽流感诊疗方案（2013年第2版）》
　　　　3.《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》（卫医发[2002]10号）
　　　　【生产企业】
　　　　企业名称：北京金豪制药股份有限公司
　　　　生产地址：北京市北京经济技术开发区运成街7号
　　　　注册地址：北京市北京经济技术开发区运成街7号1号楼
　　　　邮政编码：100176
　　　　电话号码：010-67878866
　　　　传真号码：010-67881632
　　　　网    址：www.kinghawk828.com
　　　　【医疗器械生产企业许可证编号】京药监械生产许20050017号
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　

H7N9禽流感病毒核酸检测试剂盒
（PCR-荧光探针法）说明书
　　　　 
　　　　【产品名称】通用名称：H7N9禽流感病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）
　　　　英文名称：Detection Kit for Avian Influenza Virus Subtype H7N9 RNA (PCR-Fluorescence Probing)  
　　　　【包装规格】大包装，48反应/盒
　　　　【预期用途】
　　　　流感病毒可分为甲（Ａ）、乙（Ｂ）、丙（Ｃ）三型。其中，甲型流感依据流感病毒血凝素蛋白（HA）的不同可分为1-16种亚型，根据病毒神经氨酸酶蛋白（NA）的不同可分为1-9种亚型，HA不同亚型可以与NA的不同亚型相互组合形成不同的流感病毒。而禽类特别是水禽是所有这些流感病毒的自然宿主，H7N9禽流感病毒是其中的一种。H7N9流感病毒既可以感染禽类，也可以感染人。人感染H7N9禽流感会出现严重肺炎，症状包括发烧、咳嗽、呼吸困难等。
　　　　本试剂盒适用于检测呼吸道样本、血清、肺组织等样本中H7N9禽流感病毒RNA，可用于该病毒感染的实验室诊断和宿主动物的监控。检测结果仅供研究，不用于临床诊断。
　　　　【检验原理】
　　　　本试剂盒基于实时荧光PCR技术，分别选取H7N9禽流感病毒的HA基因和NA基因保守区作为扩增靶区域，设计特异性引物探针，通过一步法实时荧光PCR体系扩增对H7N9禽流感病毒进行定性检测。反应体系中除特异性引物和特异性荧光探针外，还配以对应的PCR反应Buffer、逆转录酶、Hot-Start Taq酶、核苷酸单体（dNTPs）、Mg2+等成分，可实现对H7N9禽流感病毒核酸灵敏特异地检测。
　　　　【主要组成成分】
组分名称 规格 数量
PCR检测试剂 AIV H7 PCR反应液A 816µl/管 1
AIV N9 PCR反应液A 816µl/管 1
AIV H7N9 PCR反应液B 288µl/管 1
AIV H7N9内标溶液 240µl/管 1
质控品 阴性质控品  200µl/管 1
AIV H7N9阳性质控品 200µl/管 1
 
　　　　【储存条件及有效期】保存于-20±5℃，反复冻融次数＜5次，有效期9个月。
　　　　【适用仪器】ABI 7500、ABI 7300、LightCycler480等荧光定量PCR仪。
　　　　【样本要求】
　　　　1 适用样本类型：呼吸道样本、血清、肺组织。
　　　　2 样品采集、保存与运送。
　　　　标本采集、保存、运送请遵循《人感染H7N9禽流感病毒标本采集及实验室检测策略》。
　　　　【检验方法】
　　　　1.核酸提取
　　　　建议取200µl液态样本进行核酸提取；组织样本可以研磨液进行提取操作。可采用中山大学达安基因股份有限公司生产的核酸提取试剂盒，请按照试剂盒说明书进行操作；也可选择其他合适的商业化产品。本试剂盒中的内标溶液参与提取过程，若提取试剂盒中未说明内标的使用方法可在每200µl样本中加入4µl内标溶液后进行核酸提取。
　　　　本试剂盒中的阴性质控品参与提取，用于对环境进行监控；AIV H7N9阳性质控品不参与提取，用于PCR检测试剂的质控。
　　　　2.PCR扩增（ABI 7500仪器操作为例，ABI 7300、LC480等仪器参照此操作及仪器操作手册）
　　　　2.1分别配制AIV H7 RT-PCR反应体系和AIV N9 RT-PCR反应体系
　　　　2.1.1 AIV H7 RT-PCR反应体系配制
　　　　取适量PCR反应管（按AIV H7反应体系计算）；每管加入AIV H7 PCR反应液A 17µl、AIV H7N9 PCR反应液B 3µl（也可按照单个反应的用量，计算PCR反应液A、B各自所需总量，两者混匀后分装20µl于单个PCR反应管中）。
　　　　2.1.2 AIV N9 RT-PCR反应体系配制
　　　　取适量PCR反应管（按AIV N9反应体系计算）；每管加入AIV N9 PCR反应液A 17µl、AIV H7N9 PCR反应液B 3µl（也可按照单个反应的用量，计算PCR反应液A、B各自所需总量，两者混匀后分装20µl于单个PCR反应管中）。
　　　　2.2 于上述PCR反应管中分别加入处理后的阴性质控品、AIV H7N9阳性质控品、待测标本核酸各5µl，8,000rpm离心数秒，放入PCR扩增仪。
　　　　2.3探针检测模式设置为：Reporter Dye1：FAM，Quencher Dye：NONE，Reporter Dye2：Vic，Quencher Dye2：NONE， Passive Reference：NONE。反应条件设置为：50℃ 15min，1个循环；95℃ 15分钟，1个循环；94℃ 15秒→58℃ 45秒（收集荧光），45个循环。保存文件，运行。
　　　　3.结果分析
　　　　3.1 反应结束后保存检测数据文件。
　　　　3.2 分析条件设置：根据分析后图像调节Baseline的start值、stop值以及Threshold的Value值（用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3～15、End值可设在5～20，调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线），点击Analysis自动获得分析结果，在Report界面察看结果。
　　　　【质量控制】
　　　　阴性质控品：FAM检测通路扩增曲线无对数增长期，VIC检测通路扩增曲线为明显对数增长期；
　　　　阳性质控品：FAM检测通路扩增曲线有明显对数增长期，且FAM检测通道扩增曲线 Ct值≤32；
　　　　以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
　　　　【结果判定】
　　　　1.如果检测样品的AIV H7及N9 RT-PCR反应体系FAM检测通道均无扩增曲线或Ct值＞40，且在VIC检测通道均有对数增长期，可判样品为H7N9禽流感病毒阴性；
　　　　2.如果检测样品的AIV H7及N9 RT-PCR反应体系扩增曲线在FAM,VIC检测通道均有对数增长期且FAM检测通道Ct值≤40；可判样品为H7N9禽流感病毒阳性；
　　　　3.如果检测样品的AIV H7或N9 RT-PCR反应体系仅其中之一的扩增曲线满足判为阳性的要求，则需重复检测；若重复检测结果为H7及N9均阳性，则判H7N9禽流感病毒阳性；若重复检测结果仍为H7（或N9）阳性，则只能判禽流感病毒H7（或N9）亚型阳性，并建议以其他方法做进一步确认。
　　　　【检测方法的局限性】
　　　　1.样本检测结果与样本收集、处理、运送及保存质量有关。
　　　　2.样本处理时没有控制好交叉污染，可能出现假阳性结果。
　　　　3.病毒在流行过程中的基因突变则也可能导致假阴性结果。
　　　　4.由于不同提取方法的原理不同，采用不同核酸提取试剂进行样本处理时核酸提取效率存在一定差异，本试剂盒推荐使用本公司生产的核酸提取试剂盒（离心柱法），用户可根据具体要求进行选择确认。
　　　　5.本检测结果仅供临床参考，如需确诊病例请结合临床症状及其他检测手段.
　　　　【产品性能指标】
　　　　根据产品分析性能评估结果，本试剂盒的分析灵敏度为1.0×103copies/ml。与感染部位相同或感染症状相似的其他病原体（甲型流感病毒H3亚型、甲型流感病毒H1亚型、乙型流感病毒、副流感病毒、禽流感H5亚型病毒、禽流感H9亚型病毒等）无交叉反应。
　　　　【注意事项】
　　　　1.实验室管理应严格按照PCR基因扩增实验室的管理规范，实验人员必须进行专业培训，实验过程严格分区进行（试剂准备区、标本制备区、扩增和产物分析区），所用消耗品应灭菌后一次性使用，实验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备，各区各阶段用品不能交叉使用；
　　　　2.为试剂和标本准备阶段提供生物安全柜，实验过程中穿工作服，带一次性手套，使用自卸管移液器；
　　　　3.试剂使用前要完全解冻，8,000rpm离心数秒后使用；
　　　　4.标本制备区所用过的吸头请打入盛有消毒剂的容器，并与废弃物一起灭菌后方可丢弃；
　　　　5.实验完毕用10%次氯酸或75%酒精或紫外线灯处理工作台和移液器；
　　　　6.本试剂盒内阳性质控品应视为具有传染性物质，操作和处理均需符合相关法规要求：卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通用准则》和《医疗废物管理条例》。
　　　　【生产企业】企业名称：中山大学达安基因股份有限公司
　　　　生产地址：广州市高新技术产业开发区香山路19号；广州市高新技术产业开发区荔枝山路6号
　　　　邮   编：510665          
　　　　电   话：020-32290789、8008304008
　　　　传   真：020-32068820   
　　　　网   址：http://www.daangene.com
　　　　【医疗器械生产企业许可证编号】粤食药监械生产许20040999号
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
附件2

人感染H7N9禽流感病毒核酸检测实验室生物安全保障基本要求
 


　　　　为加强人感染H7N9禽流感病毒核酸检测规范化管理，做好实验室生物安全管理工作，根据《病原微生物实验室生物安全管理条例》（国务院第424号令，以下简称《管理条例》）、《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》（卫生部45号令，以下简称《管理规定》）等有关要求，制定本标准。供医院开展人感染H7N9禽流感病毒核酸检测时参考使用。
　　　　一、样本采集
　　　　（一）进行人感染H7N9禽流感病毒相关样本（以下简称“样本”）采集的操作人员必须经过生物安全培训合格，并具备相应的操作技能。
　　　　（二）样本采集过程中，操作人员要加强防护，应当穿戴防护服、眼罩、N95及以上水平的医用防护口罩、双层医用乳胶手套、帽子等个体防护装备。
　　　　（三）用于样本采集的主容器必须采用优质塑料材质，且大小适合、带螺旋盖、内有垫圈、无菌、耐冷冻的密闭容器。样本采集后，主容器盖必须盖严、拧紧，表面应当擦拭消毒。
　　　　（四）对诊疗过程中采集的各种临床样本，医疗机构应当加强生物安全管理，在进行动态风险沟通与评估基础上，采取样本登记造册、专库存放、专人负责以及必要的消毒处理等较严格的安全及安保管理措施。
　　　　（五）样本采集过程中产生的医疗废物要分类收集，应当在产生地点进行压力蒸汽灭菌或可靠的化学消毒，然后按感染性、损伤性等医疗废物收集处置。
　　　　二、样本包装和运输
　　　　（一）负责样本包装和运输的人员应当经过感染性物质包装、运输相关的生物安全培训，并取得相应资格。
　　　　（二）运输样本必须采取三层包装系统，由内到外分别为主容器、辅助容器和外包装。
　　　　病毒培养物按照A类感染性物质进行包装运输，其他感染性物质按照B类感染性物质进行包装运输。
　　　　容器或包装材料应当达到国际民航组织《危险物品航空安全运输技术细则》相应包装标准，符合防水、防破损、防外泄、耐高温、耐高压的要求。
　　　　（三）样本包装过程中，操作人员要根据所处环境条件参照本标准第一条第二款的相关要求采取加强防护。
　　　　（四）操作人员应当规范包装检测样本：
　　　　1.应当在实验室核心操作区内对装有样本的主容器外表面进行仔细检查并擦拭消毒，确保无泄漏、表面无残留物，并在外表面标明样本编号、种类、姓名及采样日期等信息。用足够的吸收材料包裹主容器，然后放入辅助容器，拧紧（A类）或封严（B类）辅助容器，必要时消毒辅助容器外表面。若多个主容器装入同一个辅助容器时，必须分别包裹，防止彼此接触，并在多个主容器外面衬以足够的吸收材料。
　　　　2.应在实验室清洁区采用适当的衬垫材料将辅助容器固定在贴有统一标识的外包装箱内，冰排或制冷器件应放在辅助容器和外包装之间。样本送检单、样本接收证明、准运证书、运送人员资质证明、发送和接收人员信息等相关文件材料应当放入防水的塑料袋中，置于外包装箱内上方。
　　　　（五）样本运输前应当联系接收机构实验室，告知样本送检目的、样本种类、数量和预计送达的时间等。
　　　　（六）负责运输样本的医疗卫生机构，应当按照《管理规定》有关要求，向省级卫生行政主管部门或中国疾病预防控制中心申请办理《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本准运证书》。在每次运输结束后，运输单位须将运输情况向省级卫生行政主管部门或中国疾病预防控制中心书面报告。
　　　　（七）包装合格的样本（三层包装系统）可通过航空或陆路运输。陆路运输应专车运输，并由2名或以上经培训合格的人员护送。运输途中样本主容器应始终保持直立，运输车辆内应携带具备清单及有效物品的应急处置箱（包），其中包括个体防护装备、感染性材料溢洒处置器具、皮肤及创口处置器具、医疗废物收集器具以及“生物危险”、“禁止通过”等警示标识。有关单位或者个人不得通过公共电（汽）车和城市铁路运输相关样本。
　　　　三、样本接收和包装开启
　　　　（一）负责样本接收与包装开启的操作人员应具备相应的操作技能，通过生物安全培训并取得相应资质。
　　　　（二）样本包装的开启应在生物安全二级及以上级别的实验室进行。样本送检单、准运证书、人员上岗证等相关文件材料的核查、登记，以及相关风险沟通/评估和开具样本接收证明等工作应在实验室清洁区内进行。
　　　　（三）包装开启过程中，操作者要根据所处环境条件参照本标准第一条第二款相关要求适时加强防护。
　　　　（四）实验室操作人员应规范接收检测样本、开启包装：
　　　　1.操作人员应当在生物安全柜内开启三层包装系统的第二层辅助容器，并仔细检查主容器表面有否破损、泄漏或残留物，发现异常情况应当立即执行实验室应急处置程序，同时登记并报告实验室负责人。
　　　　2.操作者应当在生物安全柜内消毒主容器表面，核对样本信息，进行下一步的实验室检测活动，或转移至指定的保存/保藏地点及位置。
　　　　（五）包装开启和样本核查结束后，应当在实验室清洁区完成交接手续，开具样本接收证明，交还外包装和辅助容器等。实验室操作人员应对所有异常情况进行详细记录，运输和接受样本的双方人员签字确认。
　　　　四、样本分装和检测
　　　　（一）负责样本分装、检测的操作人员应当具备人感染H7N9禽流感病毒相应的实验操作能力，经过生物安全培训，并取得培训合格资质。
　　　　（二）实验室用于人感染H7N9禽流感病毒检测的设备、设施必须运行良好，生物安全柜和压力蒸汽灭菌器应当年检合格。
　　　　（三）在生物安全二级实验室从事相关实验活动时，操作人员应当配戴眼罩、N95及以上水平的医学防护口罩，穿戴防护服、双层乳胶手套等个体防护装备。
　　　　（四）实验室生物安全等级要求：
　　　　1.疑似病例未经培养的临床样本应当在生物安全二级实验室的生物安全柜内分装、灭活和核酸提取。
　　　　2.人感染H7N9禽流感病毒的分离培养应当在生物安全三级实验室进行。
　　　　3.动物感染实验应当在动物生物安全三级实验室进行。
　　　　（五）开展人感染H7N9禽流感病毒相关实验活动时，应当有２名以上的操作人员共同进行。
　　　　（六）实验过程中产生的医疗废物要分类收集，应在产生地点进行消毒灭菌，然后按医疗废物收集处置。
　　　　五、样本保存和销毁
　　　　（一）各医疗机构应当将阳性样本按照要求集中专库保存。
　　　　（二）阳性样本、分离物的保存及销毁应当按照《管理条例》等法规和规范性文件有关要求执行。

　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
山东省人民政府


山东省人民政府令
第238号



　　《山东省行政程序规定》已经2011年5月25日省政府第101次常务会议通过，现予公布，自2012年1月1日起施行。


　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　省　长　姜大明　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　二○一一年六月二十二日　




　
山东省行政程序规定



第一章　总　则



　　第一条　为了规范行政行为，保护公民、法人和其他组织的合法权益，保障和监督行政机关依法行政，建设法治政府，根据有关法律、法规，结合本省实际，制定本规定。

　　第二条　本省各级行政机关、法律法规授权的组织和依法受委托的组织实施行政行为，应当遵守本规定。法律、法规另有规定的，从其规定。

　　第三条　行政机关应当依照法律、法规、规章，在法定权限内，按照法定程序实施行政行为。

　　第四条　没有法律、法规、规章依据，行政机关不得作出影响公民、法人和其他组织合法权益或者增加其义务的决定。

　　第五条　行政机关应当公正行使行政权力，平等对待公民、法人和其他组织。

　　行政机关行使行政裁量权应当符合立法目的，采取的措施和手段应当必要、适当；实施行政管理可以采取多种方式实现行政目的的，应当选择最有利于保护公民、法人和其他组织合法权益的方式。

　　第六条　行政机关应当将实施行政行为的依据、过程和结果依法公开。但是涉及国家秘密、商业秘密和个人隐私的除外。

　　涉及公民、法人和其他组织权利义务的行政文件、档案，应当依法允许查阅、摘录、复制。

　　第七条　公民、法人和其他组织因行政行为取得的正当权益受法律保护。非因法定事由并经法定程序，行政机关不得撤销、变更已经生效的行政决定；因公共利益或者其他法定事由必须撤销或者变更的，应当依照法定权限和程序进行，并对公民、法人和其他组织因此遭受的财产损失依法予以补偿。

　　第八条　公民、法人和其他组织有权提出行政管理的意见和建议，行政机关应当提供必要条件，采纳其合理意见和建议。

　　第九条　行政机关实施行政行为，可能影响公民、法人和其他组织合法权益的，除法定情形外，应当书面告知其事实、理由、依据，陈述权、申辩权，以及行政救济的途径、方式和期限。

　　第十条　行政机关实施行政行为，应当遵守法定期限或者承诺期限，为公民、法人和其他组织提供高效、优质服务。

　　第十一条　县级以上人民政府负责本规定在本行政区域内的实施工作。

　　县级以上人民政府法制机构和政府工作部门法制机构负责本规定实施的具体工作。县级以上人民政府办公厅(室)和机构编制、监察、人力资源社会保障、财政等部门，按照各自的职责分工，做好本规定实施的相关工作。



第二章　行政程序主体



　　第十二条　行政机关行使职权应当依照法律、法规、规章的规定。

　　法律、法规、规章对上下级行政机关之间的职权未作出明确规定的，上级行政机关应当按照有利于发挥行政效能、财权与事权相匹配、权力与责任相一致、管理重心适当下移等原则确定。

　　第十三条　行政机关的内设机构或者派出机构应当以其隶属的行政机关的名义作出行政决定，并由该行政机关承担法律责任。但是法律、法规另有规定的除外。

　　第十四条　法律、法规授权的具有管理公共事务职能的组织，在法定授权范围内，以自己的名义行使行政职权并承担相应的法律责任。

　　第十五条　行政机关可以根据法律、法规、规章的规定，委托行政机关或者具有管理公共事务职能的组织行使行政职权，受委托行政机关或者组织应当具备履行相应职责的条件，并在委托的范围内，以委托行政机关的名义行使行政职权，由此所产生的后果由委托行政机关承担法律责任。受委托行政机关或者组织不得将受委托的行政职权再委托给其他行政机关、组织或者个人。

　　委托行政机关应当将受委托主体和委托的行政职权内容向社会公告，并对受委托行政机关或者组织行使受委托行政职权的行为进行指导、监督。

　　第十六条　行政机关与受委托行政机关、组织之间应当签订书面委托协议，并报本级人民政府法制机构备案。委托协议应当包括委托依据、事项、权限、期限、双方权利和义务、法律责任等内容。

　　有下列情形之一的，应当及时解除委托协议，并向社会公布：

　　(一)委托期限届满的；

　　(二)受委托行政机关或者组织超越、滥用行政职权或者不履行行政职责的；

　　(三)受委托行政机关或者组织不再具备履行相应职责条件的；

　　(四)应当解除委托协议的其他情形。

　　第十七条　有下列情形之一的，行政机关应当请求相关行政机关协助：

　　(一)独立行使职权不能实现行政目的的；

　　(二)不能自行调查、取得所需事实资料的；

　　(三)执行公务所需文书、资料、信息为其他行政机关所掌握，自行收集难以取得的；

　　(四)应当请求行政协助的其他情形。

　　被请求协助的行政机关应当及时履行协助义务，不得推诿或者拒绝。不能提供协助的，应当以书面形式及时告知请求机关并说明理由。

　　因行政协助发生争议的，由请求机关与协助机关共同的上一级行政机关决定。

　　第十八条　行政机关的地域管辖权依照法律、法规、规章规定确定；没有明确规定的，由行政管理事项发生地的行政机关管辖，但是有下列情形之一的除外：

　　(一)涉及公民身份事务的，由其住所地行政机关管辖；住所地与经常居住地不一致的，由经常居住地行政机关管辖；住所地与经常居住地都不明确的，由最后居住地行政机关管辖；

　　(二)涉及法人和其他组织主体资格事务的，由其主要营业地或者主要办事机构所在地行政机关管辖；(三)涉及不动产的，由不动产所在地行政机关管辖。

　　第十九条　行政机关受理公民、法人和其他组织的申请或者依职权启动行政程序后，认为不属于自己管辖的，应当移送有管辖权的行政机关，并通知当事人；受移送的行政机关认为不属于自己管辖的，不得再行移送，应当报请共同上一级行政机关指定管辖。

　　公民、法人和其他组织在法定期限内提出申请，依照前款规定移送有管辖权的行政机关的，视为已在法定期限内提出申请。

　　第二十条　两个以上行政机关对同一行政管理事项都有管辖权的，由先受理的行政机关管辖；发生管辖争议的，由共同上一级行政机关指定管辖。情况紧急、不及时采取措施将对公共利益或者公民、法人和其他组织合法权益造成重大损害的，行政管理事项发生地的行政机关应当进行必要处理，并立即通知有管辖权的行政机关。

　　第二十一条　行政机关之间发生职权争议的，由争议各方协商解决；协商不成的，依照下列规定处理：

　　(一)涉及职权划分的，由有管辖权的机构编制部门提出协调意见，报本级人民政府决定；

　　(二)涉及执行法律、法规、规章的，由有管辖权的政府法制机构依法协调处理；涉及重大事项的，由政府法制机构提出意见，报本级人民政府决定。

　　第二十二条　行政机关工作人员执行公务时，有下列情形之一的，应当自行申请回避；本人未申请回避的，行政机关应当责令回避；公民、法人和其他组织也可以以书面形式提出回避申请：

　　(一)与本人有利害关系的；

　　(二)与本人有夫妻关系、直系血亲关系、三代以内旁系血亲关系以及近姻亲关系的；

　　(三)可能影响公正执行公务的其他情形。

　　行政机关工作人员的回避由该行政机关主要负责人决定。行政机关主要负责人的回避由本级人民政府或者上一级行政机关决定。

　　第二十三条　公民、法人和其他组织在行政程序中，依法享有申请权、知情权、参与权、监督权、救济权。

　　公民、法人和其他组织参与行政程序，应当履行服从行政管理、协助执行公务、维护公共利益、提供真实信息、遵守法定程序等义务。



第三章　重大行政决策程序



　　第二十四条　本规定所称重大行政决策，是指县级以上人民政府依照法定职权，对关系本地区经济社会发展全局、社会涉及面广、与公民、法人和其他组织利益密切相关的下列事项作出的决定：

　　(一)制定经济和社会发展重大政策措施，编制国民经济和社会发展规划、年度计划；

　　(二)编制各类总体规划、重要的区域规划和专项规划；

　　(三)编制财政预决算，重大财政资金安排；

　　(四)研究重大政府投资项目和重大国有资产处置；

　　(五)制定资源开发利用、环境保护、劳动就业、社会保障、人口和计划生育、教育、医疗卫生、食品药品、住宅建设、安全生产、交通管理等方面的重大政策措施；

　　(六)确定和调整重要的行政事业性收费以及政府定价的重要商品、服务价格；

　　(七)制定行政管理体制改革的重大措施；

　　(八)需要由政府决策的其他重大事项。

　　重大行政决策的具体事项，由县级以上人民政府在前款规定的范围内确定，并向社会公布。

　　第二十五条　县级以上人民政府工作部门、派出机关和乡镇人民政府的行政决策程序参照本章规定执行。

　　起草地方性法规草案和制定政府规章，适用《中华人民共和国立法法》等有关法律、法规、规章的规定。

　　突发事件应对的行政决策程序，适用《中华人民共和国突发事件应对法》等有关法律、法规、规章的规定。

　　第二十六条　县级以上人民政府应当建立健全公众参与、专家论证和政府决定相结合的行政决策机制，完善行政决策的智力和信息支持系统，实行依法决策、科学决策、民主决策。

　　第二十七条　政府行政首长代表本级政府对重大行政事项行使决策权。决策事项承办单位依照法定职责确定或者由政府行政首长指定。

　　第二十八条　决策事项承办单位应当深入调查研究，全面、准确掌握决策所需信息，并按照决策事项涉及的范围征求有关方面意见，充分协商协调，结合实际拟定决策方案。

　　对需要进行多个方案比较研究或者争议较大的事项，应当拟定两个以上可供选择的决策方案。

　　第二十九条　决策事项承办单位应当对重大行政决策方案进行社会稳定、环境、经济等方面的风险评估；未经风险评估的，不得作出决策。

　　决策事项承办单位应当对重大行政决策方案进行合法性论证，必要时也可以进行成本效益分析。

　　第三十条　决策事项承办单位应当组织相关领域专家或者研究咨询机构，对重大行政决策方案进行必要性、可行性、科学性论证。专家论证意见应当作为政府决策的重要依据。

　　第三十一条　决策事项承办单位应当根据重大行政决策对公众影响的范围和程度，采用座谈会、论证会和互联网发布等形式广泛听取公众意见，对合理意见应当予以采纳；未予采纳的，应当以适当方式说明理由。

　　第三十二条　重大行政决策有下列情形之一的，决策事项承办单位应当举行听证会：

　　(一)法律、法规、规章规定应当听证的；

　　(二)可能影响社会稳定的；

　　(三)公众对决策方案有重大分歧的。

　　第三十三条　决策事项承办单位应当在听证会举行15日前公告下列事项：

　　(一)举行听证会的时间、地点；

　　(二)拟作出行政决策的内容、理由、依据和背景资料；

　　(三)申请参加听证会的时间、方式。

　　第三十四条　与听证事项有利害关系的公民、法人和其他组织，可以申请参加听证会。

　　决策事项承办单位应当根据听证公告确定的条件、受理申请的先后顺序和持不同意见人员比例相当的原则，合理确定参加人。决策事项承办单位可以根据需要邀请有关专业人员、专家学者参加听证会。

　　申请参加听证会的人数较多的，决策事项承办单位应当随机选择参加人。

　　听证参加人的基本情况应当向社会公布。

　　第三十五条　听证会应当按照下列程序进行：

　　(一)听证记录人查明听证参加人到场情况，宣布听证会纪律；

　　(二)听证主持人宣布听证会开始，介绍听证主持人、听证记录人，宣布听证会内容；

　　(三)决策事项承办单位工作人员陈述；

　　(四)听证参加人发表意见；

　　(五)围绕听证事项进行辩论。

　　听证会应当制作笔录，并交听证参加人签字或者盖章。听证主持人根据笔录制作的听证报告应当作为政府决策的重要依据。

　　第三十六条　重大行政决策方案提交政府常务会议或者全体会议讨论前，决策事项承办单位应当将该方案交本级人民政府法制机构进行合法性审查。未经合法性审查或者经审查不合法的，不得提交会议讨论并作出决策。

　　合法性审查的内容应当包括下列事项：

　　(一)是否违反法律、法规、规章的规定；

　　(二)是否超越法定职权；

　　(三)是否违反法定程序；

　　(四)需要进行合法性审查的其他事项。

　　第三十七条　政府行政首长将重大行政决策方案提交政府常务会议或者全体会议讨论，按照下列程序进行：

　　(一)决策事项承办单位作决策方案说明；

　　(二)政府法制机构作合法性审查说明；

　　(三)政府分管负责人发表意见；

　　(四)会议其他组成人员发表意见；

　　(五)政府行政首长发表意见。

　　第三十八条　重大行政决策在集体讨论的基础上，由政府行政首长作出同意、不同意、修改、暂缓或者再次讨论的决定。

　　作出暂缓决定超过1年的，决策方案退出重大行政决策程序。

　　政府常务会议或者全体会议应当记录重大行政决策方案的讨论情况及决定，对不同意见应当载明。

　　第三十九条　重大行政决策方案依法应当报上级人民政府批准或者提请同级人民代表大会及其常务委员会审议决定的，县级以上人民政府应当按照程序上报批准或者提请审议决定。

　　第四十条　县级以上人民政府作出重大行政决策后，应当依照政府信息公开的有关规定，自作出决定之日起20日内向社会公布。

　　第四十一条　县级以上人民政府应当通过跟踪调查、考核等措施，对重大行政决策事项执行情况进行督促检查。执行机关应当按照各自职责，全面、及时、正确地贯彻执行。监督机关应当加强对重大行政决策事项执行情况的监督。

　　执行机关发现重大行政决策所依赖的客观条件发生变化或者因不可抗力导致决策目标部分或者全部不能实现的，应当及时报告；执行机关、监督机关及公民、法人和其他组织认为决策及其执行违法或者不适当的，可以向决策机关提出。决策机关应当认真研究，并根据实际情况作出继续执行、停止执行、暂缓执行或者修订决策的决定。

　　第四十二条　县级以上人民政府应当定期对重行政大决策的执行情况组织评估，并将评估结果向社会公开。



第四章　规范性文件制定程序



　　第四十三条　本规定所称规范性文件，是指除政府规章外，行政机关在法定职权范围内，按照法定程序制定并公开发布的，对公民、法人和其他组织具有普遍约束力，可以反复适用的规定、办法、规则等行政公文。

　　行政机关制定的内部工作制度、人事任免决定、对具体事项的处理决定、工作部署、向上级行政机关的请示和报告以及其他对公民、法人和其他组织的权利义务没有直接影响、不具有普遍约束力、不可以反复适用的公文，不适用本规定。

　　各级人民政府、县级以上人民政府办公厅(室)制定的规范性文件，为政府规范性文件。县级以上人民政府工作部门制定的规范性文件，为部门规范性文件。

　　议事协调机构、政府工作部门的派出机构和部门内设机构不得制定规范性文件。

　　第四十四条　规范性文件不得设定行政许可、行政处罚、行政强制等事项，不得违法限制或者剥夺公民、法人和其他组织合法权利，不得违法增加公民、法人和其他组织的义务。

　　规范性文件对实施法律、法规、规章以及上级规范性文件作出具体规定的，不得与所依据的规定相抵触。

　　第四十五条　涉及两个以上政府工作部门职权范围内的事项，需要制定规范性文件的，应当由本级人民政府制定政府规范性文件，或者由有关部门联合制定部门规范性文件。

　　制定部门规范性文件，涉及社会关注度高或者涉外、涉港澳台事项时，应当事先请示本级人民政府同意。

　　第四十六条　制定规范性文件由行政机关依职权启动，公民、法人和其他组织也可以提议制定规范性文件。

　　第四十七条　制定规范性文件，应当采取座谈会、论证会、公开征求意见等方式广泛听取意见。

　　规范性文件的内容涉及重大公共利益的，公众有重大分歧的，可能影响社会稳定的，或者法律、法规、规章规定应当听证的，起草部门应当组织听证。

　　规范性文件涉及重大行政决策的，适用重大行政决策程序的规定。

　　第四十八条　制定规范性文件应当进行合法性审查。合法性审查由制定机关的法制机构负责，分别就制定主体、权限、程序、内容、形式是否合法进行审查，并向制定机关提交合法性审查报告。对合法性审查中发现的问题，依照下列规定处理：

　　(一)制定机关不具有制定该规范性文件的法定权限，或者主要内容不合法的，建议不制定该规范性文件；

　　(二)应当事先请示本级人民政府同意的部门规范性文件，尚未请示的，建议待请示本级人民政府同意后再制定；

　　(三)应当公开征求意见但是尚未征求、应当组织听证但是尚未组织、应当经专家论证但是尚未论证的，建议退回起草部门补正程序；

　　(四)具体规定不合法的，提出具体修改意见。

　　第四十九条　制定对公民、法人和其他组织的权利义务产生直接影响的规范性文件，应当由制定机关负责人集体讨论决定，并由制定机关主要负责人或者其委托的负责人签署。

　　因发生重大自然灾害、事故灾难、公共卫生事件或者其他社会安全事件，以及执行上级机关的紧急命令和决定等紧急情况需要立即制定规范性文件的，经合法性审查后，可以直接提请制定机关主要负责人或者其委托的负责人决定和签署。

　　第五十条　制定规范性文件实行统一登记、统一编制登记号、统一公布制度。未经统一登记、统一编制登记号、统一公布的规范性文件无效，不得作为行政管理的依据。

　　第五十一条　县级以上人民政府及其办公厅(室)的规范性文件，由本级人民政府法制机构在完成合法性审查后登记、编制登记号。

　　部门规范性文件应当自签署、编制文号之日起5日内，由制定机关的法制机构将规范性文件纸质文本与电子文本、起草说明、合法性审查报告和制定依据等材料送本级人民政府法制机构。符合要求的，政府法制机构应当自受理之日起5日内登记、编制登记号，出具《规范性文件登记通知书》；不符合要求的，不予登记并书面说明理由。

　　县级以上人民政府派出机关和乡镇人民政府的规范性文件参照前款规定，由其上一级人民政府法制机构登记、编制登记号。

　　县级以上人民政府法制机构应当将规范性文件自登记、编制登记号之日起5日内交本级人民政府办公厅(室)，通过政府公报、政府网站统一公布。

　　第五十二条　县级以上人民政府及其办公厅(室)的规范性文件，应当按照规定自统一公布之日起30日内向上一级人民政府报送备案。部门规范性文件和县级以上人民政府派出机关、乡镇人民政府的规范性文件，经登记、编制登记号后，不再另行报送备案。

　　第五十三条　规范性文件应当载明有效期和施行日期。

　　规范性文件有效期为3年至5年；标注“暂行”、“试行”的规范性文件，有效期为1年至2年。有效期届满的，规范性文件自动失效。规范性文件施行日期与公布日期的间隔不得少于30日。但是，规范性文件公布后不立即施行将影响法律、法规、规章、上级规范性文件执行，或者不利于保障国家安全、公共利益的，可以自公布之日起施行。

　　制定机关应当于规范性文件有效期届满前6个月内进行评估，认为需要继续执行的，按照本规定重新登记、编制登记号、公布，并自公布之日起重新计算有效期；需要修订的，按照制定程序办理。

　　第五十四条　县级以上人民政府应当及时公布现行有效的和已经失效的规范性文件目录，方便公民、法人和其他组织查询。

　　第五十五条　公民、法人和其他组织认为规范性文件违法的，可以向制定机关或者本级人民政府法制机构提出书面审查申请。接到申请的制定机关或者政府法制机构应当受理，并自收到申请之日起60日内作出处理；情况复杂，不能在规定期限内处理完毕的，经审查机关负责人批准，可以适当延长，但是延长期限最多不超过30日。处理结果应当书面告知申请人。



第五章　行政执法程序



　　第一节　一般规定

　　第五十六条　本规定所称行政执法，是指行政机关依据法律、法规、规章和规范性文件，作出的行政许可、行政处罚、行政强制、行政确认、行政征收等影响公民、法人和其他组织权利、义务的具体行政行为。

　　第五十七条　与人民群众日常生产、生活直接相关的行政执法活动，一般由设区的市、县(市、区)人民政府具有行政执法权的行政机关实施。

　　县级人民政府工作部门在必要时，可以委托乡镇人民政府实施行政执法，具体办法由省人民政府另行制定。

　　第五十八条　行政执法应当严格依照法定权限和程序，坚持严格执法、公正执法、文明执法。

　　行政机关及其执法人员依法行使行政执法权，受法律保护。任何单位和个人不得拒绝、阻碍行政执法人员依法执行公务，不得违法干预行政执法。

　　第五十九条　行政执法不得滥用行政裁量权。法律、法规、规章规定行政裁量权的，行政机关应当以规范性文件的形式，对行政裁量权的标准、条件、种类、幅度、方式、时限予以合理细化、量化。

　　细化、量化行政裁量权，应当考虑下列情形：

　　(一)所依据的法律、法规、规章规定的立法目的、法律原则；

　　(二)经济、社会、文化等客观情况的地域差异；

　　(三)行政管理事项的事实、性质、情节以及社会影响；

　　(四)可能影响行政裁量权合理性的其他情形。

　　第六十条　县级以上人民政府应当依法确认本级行政区域内行政机关的行政执法主体资格，并向社会公告。

　　省以下垂直管理的行政机关的行政执法主体资格由省人民政府依法确认，并向社会公告。

　　行政执法人员应当按照规定参加培训，经考试合格，并取得行政执法证件，持证上岗。法律、行政法规对行政执法人员的证件使用有专门规定的，从其规定。

　　国家实行垂直管理的行政机关的行政执法人员使用国家统一规定的行政执法证件的，由该行政机关报本级人民政府备案。

　　第六十一条　根据国务院的授权，省人民政府可以决定一个行政机关行使有关行政机关的行政处罚权。依法设立的集中行使行政处罚权的行政机关，是本级人民政府的行政执法部门，具有行政执法主体资格。

　　经国务院批准，省人民政府根据精简、统一、效能的原则，可以决定一个行政机关行使有关行政机关的行政许可权。

　　第六十二条　县级以上人民政府根据行政管理的需要，可以组织相关行政机关联合执法。

　　联合执法中的行政执法决定，由参加联合执法的行政机关在各自的职权范围内依法分别作出，并承担相应的法律责任。

　　第六十三条　行政执法事项需要行政机关内设的多个机构办理的，该行政机关应当确定一个机构统一办理。

　　对涉及两个以上政府工作部门共同办理的事项，县级以上人民政府可以确定一个部门统一受理申请，将相关事项抄告相关部门，实行并联办理。

　　第六十四条　行政执法直接影响公民、法人和其他组织权利义务且不属于必须立即执行的，行政机关应当先采取教育、劝诫、疏导等方式，促使其自觉履行法定义务、纠正错误。违法情节轻微，经教育后自觉履行法定义务，且未造成危害后果的，可以不予追究法律责任。

　　第六十五条　行政机关在行政执法活动中，对涉嫌犯罪的案件，应当依法移送司法机关处理。

　　第二节　程序启动

　　第六十六条　行政执法程序由行政机关依职权启动，或者依公民、法人和其他组织的申请启动。

　　行政机关依职权启动行政执法程序，应当由行政执法人员填写审批表，报本行政机关负责人批准。情况紧急的，可以事后补报。

　　公民、法人和其他组织认为自己的申请事项符合法定条件的，可以申请行政机关启动行政执法程序。

　　第六十七条　公民、法人和其他组织申请启动行政执法程序应当采取书面形式。

　　申请书应当载明下列事项：

　　(一)申请人的基本情况；

　　(二)申请事项；

　　(三)申请的事实及理由；

　　(四)申请人签名或者盖章；

　　(五)申请时间。

　　申请人书写确有困难的，没有必要以书面形式申请的，或者紧急情况的，可以口头申请，行政机关应当当场记录，经申请人阅读或者向其宣读，确认内容无误后由其签名或者盖章。

　　第六十八条　行政机关对公民、法人和其他组织提出的申请，应当根据下列情况分别作出处理：

　　(一)申请事项属于本行政机关职权范围，申请材料齐全、符合法定形式的，应当受理；

　　(二)申请事项依法不属于本行政机关职权范围的，应当当场不予受理，并告知公民、法人和其他组织向有关行政机关申请；

　　(三)申请材料存在的错误可以当场更正的，应当允许当场更正；

　　(四)申请材料不齐全或者不符合法定形式的，应当当场或者在5日内一次告知需要补正的全部内容，逾期不告知的，自收到申请材料之日起视为受理；公民、法人和其他组织在限定期限内未补正的，视为撤回申请；公民、法人和其他组织按照行政机关的要求提交全部补正申请材料的，应当受理。

　　行政机关受理或者不受理申请，应当出具加盖本行政机关印章和注明日期的书面凭证。

　　第三节　调查和证据

　　第六十九条　行政执法程序启动后，行政机关应当查明事实，收集证据。

　　行政机关调查取证时，行政执法人员不得少于2人。

　　因调查事实、收集证据确需勘查现场的，行政机关应当通知当事人或者其代理人到场；当事人或者其代理人拒绝到场的，应当在调查笔录中载明。

　　行政执法人员应当向当事人或者有关人员主动出示行政执法证件，说明调查事项和依据，否则当事人或者有关人员有权拒绝接受调查和提供证据。

　　第七十条　公民、法人和其他组织应当配合行政机关调查，提供与调查有关的真实材料和信息。知晓有关情况的其他公民、法人和其他组织应当协助行政机关调查。因协助调查产生的合理费用由行政机关承担。调查取证应当制作笔录，由行政执法人员、当事人或者其代理人、见证人签字；当事人或者其代理人、见证人拒绝签字的，不影响调查结果的效力，但是应当在调查笔录中载明。

　　第七十一条　行政机关应当依照法定程序，采取合法手段，客观、全面地收集证据，不得仅收集对当事人不利的证据。

　　当事人有权以书面、口头或者其他方式向行政机关提供证据。

　　当事人有权提出调查证据的申请。行政机关不受理申请的，应当说明理由，并记录在卷。

　　第七十二条　行政执法证据有下列几种：

　　(一)书证；

　　(二)物证；

　　(三)当事人陈述；

　　(四)证人证言；

　　(五)视听资料；

　　(六)鉴定结论；

　　(七)勘验笔录、现场笔录。

　　第七十三条　下列证据材料不得作为行政执法决定的依据：

　　(一)违反法定程序收集的；

　　(二)以非法偷拍、偷录、窃听等手段侵害他人合法权益取得的；

　　(三)以利诱、欺诈、胁迫、暴力等不正当手段取得的；

　　(四)没有其他证据印证、且相关人员不予认可的证据复制件或者复制品；

　　(五)被技术处理而无法辨认真伪的；

　　(六)不能正确表达意志的证人提供的证言；

　　(七)境外形成的未办理法定证明手续的；

　　(八)不具备合法性、真实性和关联性的其他证据材料。

　　第七十四条　行政机关及其行政执法人员不得因当事人、利害关系人提出异议或者申辩而加重处理。

　　对于当事人、利害关系人的陈述和申辩，行政机关应当予以记录并归入案卷。

　　对当事人、利害关系人提出的事实和证据，行政机关应当进行审查，采纳其合理意见；不予采纳的，应当说明理由。

　　第四节　听　证

　　第七十五条　有下列情形之一，行政机关组织听证的，适用本节规定：

　　(一)法律、法规、规章规定行政执法决定作出前应当听证的；

　　(二)行政机关依法告知听证权利后，当事人、利害关系人申请听证的；

　　(三)行政执法决定作出前，当事人、利害关系人主动申请听证，行政机关认为确有必要的；

　　(四)行政机关认为有必要听证的其他情形。

　　听证应当公开举行，但是涉及国家秘密、商业秘密和个人隐私的除外。

　　公开举行的听证会，公民、法人和其他组织可以申请旁听。

　　第七十六条　当事人、利害关系人主动申请听证或者行政机关依法告知听证权利，当事人、利害关系人申请听证的，应当在规定期限内提出书面申请。

　　当事人、利害关系人超过规定期限未申请的，视为放弃听证权利。

　　第七十七条　当事人、利害关系人申请听证符合条件的，行政机关应当自接到申请之日起5日内受理，并自受理之日起20日内组织听证；不符合条件的，应当自接到申请之日起5日内书面告知，并说明理由。

　　第七十八条　行政机关组织听证，利害关系人明确的，应当在举行听证会的7日前，书面通知当事人、利害关系人下列事项：

　　(一)听证事项、内容；

　　(二)听证会举行的时间、地点；

　　(三)听证机关的名称、地址；

　　(四)听证主持人、记录人的姓名、职务；

　　(五)当事人、利害关系人的权利和义务；

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